LRP1 ist ein neuronaler Rezeptor für α | Hefei TPR Handschuhe Co., Ltd

Molecular Neurodegeneration Band 17, Artikelnummer: 57 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Aggregation und Ausbreitung des Proteins α-Synuclein (α-Syn) und die damit verbundene neuronale Toxizität sind die wichtigsten pathologischen Merkmale der Parkinson-Krankheit (PD) und der Lewy-Körper-Demenz (LBD). Studien haben gezeigt, dass sich pathologische Spezies von α-Syn und Tau auf Prionen-ähnliche Weise zwischen Neuronen ausbreiten können, obwohl diese beiden Proteine unterschiedliche pathologische Rollen spielen und zu unterschiedlichen neurodegenerativen Erkrankungen beitragen. Es wird berichtet, dass das Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-verwandte Protein 1 (LRP1) die Ausbreitung von Tau-Proteinen reguliert; Die molekularen Regulationsmechanismen der Aufnahme und Ausbreitung von α-Syn und die Frage, ob diese auch durch LRP1 reguliert werden, sind jedoch noch wenig verstanden.

Wir haben mithilfe einer CRISPR/Cas9-Strategie isogene LRP1-Knockout-Linien (LRP1-KO) humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) etabliert und iPSC-abgeleitete Neuronen (iPSNs) generiert, um die Rolle von LRP1 bei der α-Syn-Aufnahme zu testen. Wir behandelten die iPSNs mit fluoreszierend markiertem α-Syn-Protein und maßen die Internalisierung von α-Syn mittels Durchflusszytometrie. Drei Formen von α-Syn-Spezies wurden getestet: Monomere, Oligomere und vorgeformte Fibrillen (PFFs). Um zu untersuchen, ob die Lysinreste von α-Syn an der LRP1-vermittelten Aufnahme beteiligt sind, haben wir die Amine von Lysinen auf α-Syn mit Sulfo-NHS-Acetat verschlossen und dann die Internalisierung gemessen. Wir haben auch getestet, ob der N-Terminus von α-Syn für die LRP1-vermittelte Internalisierung entscheidend ist. Schließlich untersuchten wir die Rolle von Lrp1 bei der Regulierung der α-Syn-Ausbreitung mit einem neuronalen Lrp1-Conditional-Knockout-Mausmodell (Lrp1-nKO). Wir erzeugten Adeno-assoziierte Viren (AAVs), die eine Unterscheidung zwischen der α-Syn-Expression und der Ausbreitung ermöglichten, und injizierten sie in den Hippocampus von sechs Monate alten Lrp1-nKO-Mäusen und den Wurfgeschwister-Wildtyp-(WT)-Kontrollen. Die Ausbreitung von α-Syn wurde drei Monate nach der Injektion bewertet.

Wir fanden heraus, dass die Aufnahme von sowohl monomerem als auch oligomerem α-Syn in iPSNs mit LRP1-KO im Vergleich zu den WT-Kontrollen signifikant verringert war. Die Aufnahme von α-Syn-PFFs wurde auch in LRP1-KO-iPSNs gehemmt, wenn auch in viel geringerem Maße im Vergleich zu α-Syn-Monomeren und -Oligomeren. Die Blockierung von Lysinresten auf α-Syn verringerte effektiv die Aufnahme von α-Syn in iPSNs und der N-Terminus von α-Syn war entscheidend für die LRP1-vermittelte α-Syn-Aufnahme. Schließlich war bei den Lrp1-nKO-Mäusen die Ausbreitung von α-Syn im Vergleich zu den WT-Wurfgeschwistern deutlich verringert.

Wir identifizierten LRP1 als Schlüsselregulator der neuronalen Aufnahme von α-Syn sowie als wichtigen Mediator der Ausbreitung von α-Syn im Gehirn. Diese Studie liefert neue Erkenntnisse über die physiologische und pathologische Rolle von LRP1 beim α-Syn-Handel und in der Pathologie und bietet Einblicke in die Behandlung von Synukleinopathien.

Das α-Synuclein (α-Syn) ist ein 140 Reste umfassendes Protein, das vom SNCA-Gen kodiert wird und im Nervensystem, vorwiegend in Neuronen, reichlich exprimiert wird [1, 2]. Das α-Syn-Protein ist an den präsynaptischen Enden angereichert, wo es die normale Struktur des löslichen N-Ethylmaleimide-Sensitive-Factor-Attachment-Protein-Rezeptors (SNARE)-Komplexes aufrechterhält [3] und spielt somit eine wichtige Rolle bei synaptischen Prozessen wie dem Vesikelhandel/-recycling und Neurotransmitterfreisetzung [4,5,6,7]. Es wurde gezeigt, dass α-Syn-Protein in den extrazellulären Raum, einschließlich der interstitiellen Hirnflüssigkeit (ISF), der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und des Plasmas, sezerniert werden kann, obwohl der genaue Mechanismus der α-Syn-Sekretion nicht genau verstanden ist [8,9]. ,10,11]. Wichtig ist, dass dieses sezernierte lösliche α-Syn von verschiedenen Zellen aufgenommen werden kann. Insbesondere die oligomeren α-Syn-Spezies scheinen anfällig für die Aufnahme und Ausbreitung von Zelle zu Zelle auf prionartige Weise zu sein, was zu einer templatgesteuerten Fehlfaltung der nativen Formen von α-Syn und zur Bildung von durchgehenden α-Syn-Aggregaten führt des Gehirns, die die bestimmenden pathologischen Merkmale der Parkinson-Krankheit (PD) und der Demenz mit Lewy-Körperchen (DLB) sind [12,13,14,15,16,17,18,19]. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen der Aufnahme und Ausbreitung von α-Syn sind jedoch nach wie vor kaum verstanden.

Das Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor (LDLR)-verwandte Protein 1 (LRP1) ist ein Transmembranrezeptor, der zur LDLR-Familie gehört [20]. LRP1 vermittelt und reguliert die Endozytose von > 30 Liganden, darunter Apolipoprotein E (APOE) und Amyloid-β (Aβ) [21,22,23,24,25,26,27] und spielt somit eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von Alzheimer Krankheit (AD) [28]. Eine aktuelle Studie identifizierte LRP1 auch als Schlüsselregulator für die Aufnahme und Ausbreitung von Mikrotubuli-assoziiertem Protein Tau [29]. Obwohl Tau und α-Syn wesentliche Unterschiede in ihren pathologischen Rollen aufweisen, weisen sie doch Ähnlichkeiten bei der Übertragung von Zelle zu Zelle und der pathologischen Ausbreitung auf [30]. Tau interagiert mit LRP1 über Lysinreste in der Mikrotubuli-bindenden Wiederholungsregion [29]. Bemerkenswerterweise hat α-Syn einen ähnlich hohen Gehalt (10 %) an Lysinen wie Tau. Diese gemeinsamen Eigenschaften von Tau und α-Syn legen nahe, dass ihre Aufnahme und Ausbreitung durch den gemeinsamen multifunktionalen Rezeptor LRP1 reguliert werden könnte.

Hier in dieser Studie haben wir die Rolle von LRP1 bei der Vermittlung der Aufnahme und Ausbreitung von α-Syn mithilfe von aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleiteten Neuronen (iPSNs) und einem bedingten transgenen Mausmodell getestet. In iPSNs war die Aufnahme von monomerem und oligomerem α-Syn deutlich reduziert, als das LRP1-Gen mithilfe der CRISPR/Cas9-Strategie ausgeschaltet wurde (LRP1-KO). Wir haben außerdem bestätigt, dass die N-terminale Domäne von α-Syn über Lysinreste mit LRP1 interagiert. Schließlich konstruierten wir Adeno-assoziierte Viren (AAVs), um menschliches α-Syn in Neuronen zu exprimieren, und visualisierten die Ausbreitung von α-Syn im Gehirn von Mäusen. Wir fanden heraus, dass die Ausbreitung von α-Syn im Gehirn von Mäusen durch die Deletion von neuronalem Lrp1 verringert wurde. Insgesamt legen unsere Ergebnisse nahe, dass LRP1 ein Schlüsselregulator für die Aufnahme und Ausbreitung von neuronalem α-Syn ist, was Einblicke in die Mechanismen der α-Syn-Pathogenese bietet.

Fibroblasten einer gesunden Person (weiblich; 83 Jahre alt; APOE3/3-Genotyp), die vom Mayo Clinic Neuroregeneration Lab erhalten wurden, wurden in iPSC-Klone (MC0192) umprogrammiert. Klon Nr. 4 von MC0192 wurde als parentale iPSCs für die Genbearbeitung verwendet. Isogene LRP1-KO-iPSC-Linien wurden über eine CRISPR/Cas9-Geneditierungsmethode von ALSTEM Inc. erhalten. Drei gRNA/Cas9-Konstrukte für menschliches LRP1 wurden entwickelt, um auf Exon 6 des LRP1-Gens abzuzielen [LRP1 gRNA1: ATCTTGGCCACGTACCTGAG; LRP1 gRNA2: ATGCCAACGAGACCGTATGC; und LRP1 gRNA3: TGACTCACGGTGCAGACTGA] (Abb. S1a). Die parentalen iPSCs wurden in vollständigem mTeSRTM1-Medium plus Pen/Strep-Antibiotika bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Etwa 3 × 105 Zellen wurden mit 1,5 μg jedes gRNA/Cas9-Plasmids durch das Invitrogen Neon-Transfektionssystem transfiziert. Nach der Transfektion wurde Zelllysat verwendet, um die Knockout-Effizienz mittels PCR zu untersuchen (Primer: LRP1-F CACGGACTCTTCTCTTCCCC; LRP1-R TCCCGGCCTCTGTTCAAGAT).

Einzelne Zellen wurden in mehreren Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und 14 Tage lang kultiviert, bevor sie auf Platten mit 12 Vertiefungen expandierten. Anschließend wurde genomische DNA aus einzelnen Zellklonen extrahiert und für die PCR-Analyse zur Identifizierung von Knockout-Klonen verwendet. Knockout wurde durch DNA-Sequenzierung weiter bestätigt.

Menschliche iPSCs wurden wie zuvor beschrieben in Neuronen differenziert (31, 32). Kurz gesagt, iPSCs wurden in mit Matrigel (Corning, Kat.-Nr. 354277) beschichteten Platten unter Verwendung von mTeSR™1-Medium (Stemcell Technologies, Kat.-Nr. 85850) gehalten. Um die Bildung von Neurosphären zu initiieren, wurden iPSCs auf AggreWell 800 24-Well-Platten (Stemcell Technologies, Kat.-Nr. 34811) ausplattiert und mit neuronalem Induktionsmedium (Stemcell Technologies, Kat.-Nr. 08610) in Suspension 5–7 Tage lang kultiviert. Anschließend wurden Neurosphären auf Matrigel-beschichteten Schalen ausgesät und weitere 5–7 Tage in neuronalem Induktionsmedium kultiviert, um die Bildung neuronaler Rosetten zu induzieren. Als nächstes wurden neurale Rosetten als Einzelzellsuspension isoliert und erneut auf Matrigel-beschichteten Schalen in neuralem Induktionsmedium ausplattiert. Um die Zellen in neurale Vorläuferzellen (NPCs) zu differenzieren, wurde das Medium durch Medium für neurale Vorläuferzellen (Stemcell Technologies, Kat.-Nr. 05834) ersetzt und weitere 10–14 Tage kultiviert. NPCs wurden amplifiziert und für weitere Experimente wurden gefrorene Vorräte hergestellt. Um die Differenzierung von Neuronen zu induzieren, wurden NPCs auf Matrigel-beschichteten Platten in einem Medium für neuronale Vorläuferzellen ausgesät. Am folgenden Tag wurde das Medium durch neuronales Differenzierungsmedium ersetzt, bestehend aus DMEM/F12 und Neurobasalmedium (1:1), ergänzt mit N2, B27, BDNF (20 ng/ml), GDNF (20 ng/ml), NT3 ( 10 ng/ml), IGF (10 ng/ml), Ascorbinsäure (200 μM) (alle von Stemcell Technologies) und dbcAMP (100 nM) (Sigma-Aldrich). NPCs wurden zur Differenzierung zu Neuronen weitere 14 Tage lang mit neuronalem Differenzierungsmedium kultiviert.

Kommerzielle rekombinante Proteine, einschließlich menschliches Tau (R&D Systems, SP-495), α-Syn (Proteos, Kat.-Nr. RP-003), oligomeres α-Syn (StressMarq, Kat.-Nr. SPR-484), vorgeformte α-Syn-Fibrillen (PFFs). ) (StressMarq, Kat.-Nr. SPR-322-C), α-Syn N (1–60)-Fragment (rPeptide, Kat.-Nr. S-1011–1) und α-Syn ΔN (61–140)-Fragment (rPeptid, Kat # S-1013–1) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Alexa Fluor® 488 Ester (Life Technologies, Kat.-Nr. A10235) markiert. Nach der Markierung wurden 100 mM Glycin zugegeben, um die Reaktion abzuschrecken, und die Proteine wurden Amicon Ultra-0,5 mL Zentrifugalfiltern (Millipore, Kat.-Nr. UFC500396 –3 KDa, Kat.-Nr. UFC501096 –10 KDa und Kat.-Nr. UFC510096 –100 KDa) ausgesetzt. um jegliche nicht reagierte Markierung zu entfernen. Die fluoreszierend markierten α-Syn-PFFs wurden mit einem Qsonica Q125 Sonicator bei 30 % Amplitude für 30 Zyklen (1 s EIN, 1 s AUS) beschallt, bevor sie mit Zellen inkubiert wurden. Lysin-verkappte Proteine wurden mit Sulfo-NHS-Acetat (Thermo, Kat.-Nr. 26777) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.

Die Morphologie der α-Syn-Spezies wurde durch Negativfärbungs-Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. α-Syn-Oligomere (StressMarq, Kat.-Nr. SPR-484) und PFFs (StressMarq, Kat.-Nr. SPR-322-C) wurden bei 25 µM in Wasser hergestellt. Proben (4 μl) wurden auf kohlenstoffbeschichtete 400-Mesh-Gitter (Agar Scientific) abgelegt und 1 Minute lang inkubiert, bevor die überschüssige Lösung abgetupft wurde. Die Gitter wurden mit Wasser gewaschen und trockengetupft, bevor die Proben 1 Minute lang mit 4 μl gefiltertem 0,5 % Uranylacetat negativ gefärbt wurden. Anschließend wurden die Gitter mit Filterpapier getrocknet und vor der Lagerung 5 Minuten lang an der Luft trocknen gelassen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem Jeol JEM-1400Flash-Transmissionselektronenmikroskop (Jeol) erstellt, das mit einer Matataki™ 4 M Flash-Kamera Gatan-Kamera bei einer Betriebsspannung von 80 kV ausgestattet war.

Die iPSNs bei DIV 14 wurden mit 300.000 Zellen pro Well in einer 12-Well-Platte ausplattiert. Am nächsten Tag wurde das Medium ersetzt und die Zellen wurden mit 100 nM Alexa Fluor 488-markiertem Monomer α-Syn, α-Syn N (1–60) Fragment, α-Syn ΔN (61–140) Fragment, Monomer, behandelt Tau oder 100 nM (Monomeräquivalent) markierter oligomerer α-Syn- oder beschallter α-Syn-PFFs für 3 Stunden bei 37 °C. Das mit Alexa Fluor 488 markierte Transferrin bei 300 nM wurde als Kontrolle behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, 5 Minuten lang bei 37 °C trypsiniert und von der Platte gehoben. Die Zellen wurden gesammelt und mit einem Attune™ NxT-Durchflusszytometer (Thermo Fisher) analysiert. Pro Probe wurden insgesamt 10.000 Ereignisse aufgezeichnet. Die Datenanalyse wurde mit der FlowJo-Software durchgeführt. Zuerst wurden die Zellen im Vorwärtsstreubereich/Seitenstreubereich (FSC-A/SSC-A) gesteuert; Die Zellen wurden dann auf Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) gegenüber FSC-A gesteuert, um Dubletts zu unterscheiden. Positive Zellen wurden durch Gating einer negativen Population (ohne Proteinzusatz) bestimmt.

Die Experimente wurden in biologischen Duplikaten oder Triplikaten durchgeführt und es wurden mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt. Für die Wettbewerbsexperimente mit Rezeptor-assoziiertem Protein (RAP) wurde das rekombinante RAP-Protein (hausintern) in den angegebenen Konzentrationen (1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 und 100 nM) gleichzeitig mit dem Medium hinzugefügt α-Syn-Behandlung. Für α-Syn-Fragment-Konkurrenzexperimente wurde gleichzeitig mit 488-500 nM ein fünffacher molarer Überschuss an nicht markiertem α-Syn N- (1–60) oder ΔN- (61–140) Fragment in das Medium gegeben. markiert mit α-Syn (100 nM).

Das pAAV-Synapsin-EGFP-Synapsin-mRuby2-Plasmid wurde als Rückgrat für die Erzeugung des pAAV-Synapsin-EGFP-Synapsin-h-α-Synuclein-Konstrukts verwendet [33]. Das mRuby2-Gen wurde unter Verwendung von EcoRV- und XhoI-Restriktionsstellen durch die menschliche α-Syn-cDNA voller Länge ersetzt. Das Konstrukt wurde dann wie folgt in AAV2/8 verpackt. HEK293T-Zellen (ATCC-Kat.-Nr. CRL3216) wurden bis zu einer Konfluenz von ~ 70 % in zwei Zellstacks (Corning-Kat.-Nr. 3269) pro Konstrukt kultiviert und mit PEI 25 k MW (Polysciences-Kat.-Nr. 23966–1) 3 Tage lang transfiziert. Anschließend wurden die Zellen durch Schütteln und Zentrifugieren geerntet, bis sich ein Zellpellet gebildet hatte. Das Pellet wurde dann mit einer Endkonzentration von 50 U/ml Benzonase (Sigma Kat.-Nr. E8263) und 0,5 % Natriumdesoxycholat in einem Lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,4) 30 Minuten lang bei 37 °C verdaut C. Nach der Inkubation wurde der Überstand mit 5 M NaCl ergänzt, bis eine Endkonzentration von 1 M erreicht war. Anschließend wurde der Überstand über 3 Einfrier-Auftau-Zyklen bei -80 °C und 50 °C lysiert. Das Lysat wurde abzentrifugiert und der Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen (Beckman-Kat.-Nr. 342414) überführt, wo er mit diskontinuierlichen Schichten Iodixanol (Accurate Chemical, Kat.-Nr. AN1114542) überzogen wird, um Viruspartikel aus dem Überstand abzutrennen. Dies wurde 1 Stunde lang bei 18 °C und 69.000 U/min geschleudert. Die Viruspartikel wurden isoliert und entfernt, dann viermal in einer Dialysesäule (Millipore Kat.-Nr. UFC910024) mit PBS gewaschen, bevor sie schließlich in einer Sterilfiltrationssäule (Millipore Kat.-Nr. UFC30DV00) gereinigt wurden. Gereinigte Viren wurden mittels quantitativer PCR titriert.

Die in dieser Studie verwendeten Mäuse wurden bereits zuvor beschrieben [34]. Kurz gesagt, die Lrp1-floxierten Mäuse (Lrp1flox/flox) wurden mit α-Calcium-Calmodulin-abhängigen Kinase II (CaMKII)-getriebenen Cre-Rekombinase-Mäusen (CaMKII-Cre+/-) gezüchtet, um die Lrp1-nKO-Mäuse (Lrp1flox/flox; Cre+/-) und die Cre-negativen Wurfgeschwisterkontrollen (Lrp1flox/flox; Cre−/−). Die Mäuse wurden wie beschrieben im menschlichen APOE3/3-Hintergrund gehalten [34]. Die Tiere wurden unter kontrollierten Temperatur- und Lichtbedingungen gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Tierversuche wurden vom Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und entsprachen dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

Für die stereotaktische Injektion wurden erwachsene Lrp1-nKO-Mäuse und Kontrollmäuse im Alter von 6 Monaten mit 2 % Isofluran anästhesiert. Ibuprofen wurde 48 Stunden vor der Operation im Trinkwasser verabreicht. Mit sterilen Instrumenten und Handschuhen wurde ein Längsschnitt in der Mitte des Sagittals in der Kopfhaut vorgenommen, um den Schädel freizulegen, und mit einer Handbohrmaschine wurde ein kleines Bohrloch durch den Schädel gebohrt, um das Gehirn freizulegen. Eine 10 μl-Hamilton-Spritze, die an einem Elektrodenhalter am stereotaktischen Gerät montiert war, wurde an den folgenden Koordinaten in den rechten Hippocampus eingeführt: anterior posterior, – 2,5 mm; medial-lateral, 1,5 mm; dorsal ventral, − 2,2 mm. Die Mikroinjektionen von AAVs (2 μl, 1,64 × 1014 Virusgenome pro ml) wurden mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μl pro Minute durchgeführt und die Nadel wurde nach jeder Injektion weitere 5 Minuten lang an Ort und Stelle belassen. Nach der Injektion wurde die Nadel herausgezogen und die Bohrlöcher mit sterilem Gelfoam®-Knochenwachs abgedeckt, um den Knochen abzudichten und Blutungen zu verhindern. Die Kopfhaut wurde mit chirurgischem Klebekleber verschlossen. Zur Vorbeugung einer Infektion wurde eine Dosis Ampicillin (100 mg/kg) und zur Schmerzlinderung eine Dosis Buprenorphin (0,05 mg/kg) verabreicht. Das Tier wurde unter eine heiße Lampe gestellt, bis es seinen Aufrichtreflex wiedererlangte und ohne Probleme lief, und dann in seinen Käfig gesetzt. Mäuse erhielten nach der Operation fünf Tage lang Ibuprofen in Wasser.

Drei Monate nach der AAV-Injektion wurden die Mäuse anästhesiert und transkardial mit PBS perfundiert. Eine 0,5-mm-Maushirnmatrize (Alto) wurde verwendet, um das Gehirngewebe koronal zu schneiden. Kurz gesagt, der Riechkolben und das Kleinhirn wurden entfernt und das restliche Gewebe in zwei Teile getrennt: Der 3 mm bis 1 mm große Bregma-Bereich wurde für biochemische Analysen abgetrennt und der Rest des 1 mm bis -3 mm großen Bregma-Gewebes fixiert und für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet, gemäß dem Allen Mouse Brain Atlas (siehe http://mouse.brain-map.org). Für die biochemische Analyse wurden die Gehirngewebe in RIPA-Puffer (Fisher Scientific), ergänzt durch Proteaseinhibitor (cOmplete) und Phosphataseinhibitor (PhosSTOP), homogenisiert und lysiert und 20 Minuten lang bei 4 °C und 40.000 g ultrazentrifugiert. Die Proteinkonzentration im Überstand wurde zwischen den Proben gemessen und normalisiert. Die Proben wurden in SDS-Ladepuffer gekocht und für die Western-Blot-Analyse verwendet. Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden die Gewebe 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixiert und dann in PBS gewaschen und in PBS mit 30 % Saccharose kryogeschützt. Die Gewebe wurden dann für Kryoschnitte in OCT mit 30 % Saccharose (im Verhältnis 1:1 v/v) eingebettet.

Die Gehirngewebe der Maus wurden wie oben erwähnt präpariert. Die iPSNs wurden in RIPA lysiert und die Proben wurden nach dem gleichen Protokoll wie Mausgehirnlysat vorbereitet. Das vorbereitete Mäusehirn und die iPSN-Lysate wurden einer 4–20 %igen SDS-PAGE (Bio-Rad) unterzogen und auf Polyvinylidendifluoridmembranen übertragen, die anschließend mit 5 % Milch in PBS blockiert wurden. Nach der Blockierung wurden Proteine mit einem primären Antikörper über Nacht bei 4 °C nachgewiesen. Am nächsten Tag wurden die Membranen gewaschen und mit Meerrettichperoxid (HRP) konjugierten Sekundärantikörpern untersucht und mit verstärkter Chemilumineszenz-Bildgebung entwickelt. Die primären Antikörper waren wie folgt: Anti-Human/Maus-LRP1 (hauseigener Antikörper, Klon 6F8, 1:1000), Anti-β-Actin (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. T2228, 1:3000).

Das im OCT eingebettete Hirngewebe wurde mit einer Dicke von 40 µm kryogeschnitten und die frei schwebenden koronalen Hirnschnitte wurden gesammelt. Das Gewebe wurde mit 0,25 % Triton -Syn (Biolegend, Kat.-Nr. 103–108, Klon 4B12, 1:500). Die Schnitte wurden dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Fluoreszenzsignale wurden durch Fluoreszenzmikroskopie (Modell BZ-X810, Keyence) oder konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (Modell LSM510 Invert, Carl Zeiss) nachgewiesen.

Für die Immunfluoreszenzfärbung mit iPSNs wurden die Zellen in 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit 0,25 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Nach 30-minütiger Blockierung mit 1 % BSA in PBS wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Fluoreszenzsignale wurden durch Fluoreszenzmikroskopie (Modell BZ-X810, Keyence) oder konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (Modell LSM510 Invert, Carl Zeiss) nachgewiesen. Die Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Primärantikörpern und deren Verdünnungen waren wie folgt: Nanog (Cell Signaling, Kat.-Nr. 4903, 1:300), TRA-1–60 (Abcam, Kat.-Nr. ab16288, 1:300), Sox17 (Abcam , Kat.-Nr. ab84990, 1:300), Brachyury (R&D, Kat.-Nr. AF2085, 1:300), Nestin (Abcam, Kat.-Nr. ab18102, 1:300) und Tuj1 (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. T2200, 1:1000). ).

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Alle statistischen Analysen wurden mit der Prism 8-Software durchgeführt. Zum Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde der ungepaarte t-Test verwendet, und zum Vergleich der Ergebnisse zwischen mehr als zwei Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. Alle statistischen Tests waren zweiseitig. In den Bildunterschriften haben wir die verwendeten statistischen Tests für jede Analyse, die Anzahl der Experimente und die Signifikanzniveaus angegeben.

Um die Rolle von LPR1 bei der α-Syn-Aufnahme zu untersuchen, haben wir mithilfe der CRISPR/Cas9-Technik menschliche LRP1-KO-iPSCs generiert. Es wurden zwei LRP1-KO-iPSC-Klone erhalten und die LRP1-Deletion wurde durch Sanger-DNA-Sequenzierung in jedem Klon validiert (Abb. S1b). Die Karyotypisierung in jedem iPSC-Klon ergab, dass die normale Anzahl und das normale Erscheinungsbild der Chromosomen erhalten blieben (Abb. S2a). Wir haben außerdem bestätigt, dass die LRP1-KO-iPSCs und ihre parentalen Wildtyp-iPSCs (WT) pluripotente stammzellspezifische Marker exprimierten, einschließlich Nanog und TRA-1–60 (Abb. S2b). Die parentalen und isogenen iPSC-Linien wurden dann in NPCs differenziert (Abb. 1a) und wir bestätigten durch Immunfärbung, dass alle NPCs aus den drei Linien positiv für den neuronalen Vorläufermarker (Nestin) waren (Abb. 1b). Anschließend differenzierten wir die NPCs zu Neuronen, indem wir die Zellen in neuronalem Differenzierungsmedium kultivierten (Abb. 1a). Nach 14 Tagen Kultur zeigten sowohl WT- als auch LRP1-KO-Zellen eine typische neuronale Morphologie und exprimierten den neuronalen Marker (Tuj1), was auf die erfolgreiche Differenzierung von NPCs in Neuronen (iPSNs) schließen lässt (Abb. 1c). Anschließend haben wir die Deletion von LRP1 in diesen iPSNs durch Western-Blot-Analyse bestätigt (Abb. 1d und e).

Erzeugung und Validierung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleiteten Neuronen (iPSNs) mit LRP1-Gen-Knockout (LRP1-KO). a Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs für die LRP1-KO-iPSC-Erzeugung, neuronale Differenzierung und Proteinaufnahmetests. LRP1-KO-iPSC-Kolonien wurden mithilfe der CRISPR/Cas9-Geneditierungsstrategie erhalten. Anschließend wurden aus den iPSCs neuronale Vorläuferzellen (NPCs) induziert und weiter zu iPSNs differenziert. Am 14. bis 16. Tag der iPSN-Differenzierung wurden Neuronen mit fluoreszierend markierten Proteinen behandelt und die Aufnahme wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. b Immunfluoreszenzbilder, die NPCs aus allen drei Linien (WT, LRP1-KO#1 und LRP1-KO#2) zeigen, waren positiv für den neuralen Vorläufermarker Nestin. Maßstabsbalken, 100 μm. c: Immunfluoreszenzbilder von iPSNs aller drei Zelllinien waren positiv für den neuronalen Marker Tuj1. Maßstabsbalken, 100 μm. d und e, Nachweis und Quantifizierung der LRP1-Proteinspiegel in WT- und LRP1-KO-iPSNs mittels Western Blot. f und g, Endozytose von menschlichem Tau in WT- und LRP1-KO-iPSNs, gemessen mittels Durchflusszytometrie (100 nM, 3 h Behandlung). Die Experimente in (f und g) wurden in technischen Duplikaten oder Triplikaten über drei unabhängige Experimente hinweg durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, wobei einzelne Datenpunkte angezeigt werden. Die Daten wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest analysiert. NS, nicht signifikant; ***P < 0,001

Um die zuvor berichtete Rolle von LRP1 bei der Tau-Endozytose mithilfe unserer LRP1-KO-iPSNs zu validieren (29), haben wir die Zellen mit 100 nM fluoreszierend markierten Tau-Proteinen behandelt. Drei Stunden nach der Tau-Behandlung haben wir die iPSNs geerntet und die Endozytose der Tau-Proteine mittels Durchflusszytometrie gemessen. Wir haben bestätigt, dass die Menge an internalisierten Tau-Proteinen in LRP1-KO-iPSNs im Vergleich zu WT-Zellen um ~ 90 % reduziert war (Abb. 1f und g), was mit den zuvor berichteten Angaben übereinstimmt. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass unsere Strategie der Löschung von LRP1 in menschlichen iPSNs erfolgreich war und die Tau-Aufnahme durch die Löschung von LRP1 in diesen Zellen gehemmt wurde.

Um zu testen, ob die Aufnahme von α-Syn über einen ähnlichen Mechanismus wie Tau in Neuronen erfolgt, behandelten wir die iPSNs mit fluoreszierend markiertem, monomerem α-Syn und maßen das zelluläre α-Syn-Signal durch Durchflusszytometrie nach 3-stündiger Behandlung bei einer Konzentration von 100 nM. Wir fanden heraus, dass ein LRP1-Mangel, ähnlich wie bei Tau, die zelluläre Aufnahme von α-Syn in den iPSNs signifikant reduzierte (mehr als 75 % Reduktion), und konsistente Ergebnisse wurden bei zwei verschiedenen Klonen von LRP1-KO-iPSNs beobachtet (Abb. 2a, b). , und C). Um weiter zu bestätigen, dass LRP1-KO spezifisch die Internalisierung von α-Syn und Tau beeinflusst, haben wir die iPSNs mit fluoreszierend markiertem Transferrin behandelt und konnten wie erwartet keine Verringerung der Transferrinaufnahme in den LRP1-KO-iPSNs beobachten (Abb. 2d, e). . Als nächstes testeten wir, ob RAP, ein bekannter LRP1-Bindungsantagonist [35], mit α-Syn um die neuronale Aufnahme durch LRP1 konkurrieren kann. Wir behandelten die iPSNs mit 100 nM α-Syn zusammen mit verschiedenen RAP-Konzentrationen im Bereich von 1,5625 nM bis 100 nM. Wir fanden heraus, dass RAP die neuronale Aufnahme von α-Syn dosisabhängig stark unterdrückte, wohingegen die Transferrin-Internalisierung nicht beeinträchtigt wurde (Abb. 2f). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass LRP1 ein wichtiger endozytischer Rezeptor für monomeres α-Syn in Neuronen ist.

LRP1 reguliert die α-Syn-Aufnahme in iPSNs. a und b: α-Syn-Aufnahme in WT- und LRP1-KO-iPSNs, gemessen durch Durchflusszytometrie (100 nM, 3 h Behandlung). c Repräsentative Bilder von WT- oder LRP1-KO-iPSNs nach der Aufnahme von α-Syn. Maßstabsbalken, 20 μm. d und e: Transferrin (Tfn)-Aufnahme in WT- und LRP1-KO-iPSNs, gemessen mittels Durchflusszytometrie (300 nM, 3 h Behandlung). f Aufnahme von α-Syn und Tfn in Gegenwart steigender RAP-Konzentrationen. g EM-Bilder, die die Struktur von α-Syn-Oligomeren und vorgeformten Fibrillen (PFFs) zeigen, die in Panel h verwendet werden. Maßstabsbalken, 200 nm. h Aufnahme von α-Syn-Oligomeren und PFFs in WT- und LRP1-KO-iPSNs (100 nM Monomeräquivalent, 3 h Behandlung). Alle Experimente in (a, b, d, e, f und h) wurden in technischen Duplikaten oder Triplikaten über drei unabhängige Experimente hinweg durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, wobei einzelne Datenpunkte angezeigt werden. Die Daten wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest analysiert. NS, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Darüber hinaus haben wir getestet, ob LRP1 auch die Aufnahme von oligomerem und fibrillärem α-Syn vermittelt. Wir behandelten die iPSNs mit 100 nM (Monomeräquivalent) fluoreszierend markierter α-Syn-Oligomere und beschallten α-Syn-PFFs. Die Struktur von α-Syn-Oligomeren und PFFs wurde unter Elektronenmikroskopie (EM) bestätigt (Abb. 2g). Wir fanden heraus, dass LRP1-KO auch die Aufnahme von α-Syn-Oligomeren wirksam hemmte (ca. 50 % Reduktion) (Abb. 2h). Im Gegensatz zu Tau-Fibrillen [29] hatte LRP1-KO jedoch nur eine leichte hemmende Wirkung auf die Aufnahme von α-Syn-PFFs (~ 5–10 % Reduktion) (Abb. 2h). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LRP1 der primäre Rezeptor für die Aufnahme von löslichem α-Syn, einschließlich Monomer und Oligomer, sein könnte; und die Internalisierung von aggregiertem α-Syn kann durch einen anderen oder mehrere Mechanismen vermittelt werden.

LRP1 enthält Ligandenbindungsdomänen mit cysteinreichen Komplementtyp-Wiederholungen [36]. Die Asparaginsäurereste in jeder Wiederholung können saure Taschen bilden, die für das Andocken der Lysinreste an Liganden verantwortlich sind [37]. Monomeres α-Syn besteht aus drei Domänen: einer Lipid-bindenden N-Terminus-Domäne (aa 1–60), einer hydrophoben Nicht-Amyloid-Komponentendomäne (NAC) (aa 61–95) und einer negativ geladenen C-Terminus-Domäne ( aa 96–140) [2]. α-Syn hat einen hohen Lysingehalt (15 Lysine von 140 Aminosäuren, ~ 10 %), wobei sich die meisten (elf) Lysine im N-Terminus befinden, ein Lysin im NAC und drei im C-Terminus (Abb. 3a). Um zu untersuchen, ob die Lysinreste von α-Syn an der LRP1-medikamentösen Aufnahme von α-Syn beteiligt sind, haben wir die Amine von Lysinen auf α-Syn mit Sulfo-NHS-Acetat verschlossen und dann die Internalisierung von α-Syn in den iPSNs gemessen. Wir fanden heraus, dass die Blockierung von Lysinresten auf α-Syn die Aufnahme von α-Syn in den iPSNs effektiv verringerte (ca. 50 % Reduktion) (Abb. 3b), was darauf hinweist, dass Lysinreste von α-Syn für LRP1-vermitteltes α von entscheidender Bedeutung sind -Syn-Aufnahme.

LRP1 reguliert die α-Syn-Aufnahme über Lysinreste im N-Terminus von α-Syn. a Schematische Darstellung der α-Syn-Domänen mit Hervorhebung der Lysinreste (K). b Aufnahme von α-Syn und Lysin-verkapptem α-Syn in WT-iPSNs. c, Aufnahme von α-Syn-488, N-α-Syn-488 und ΔN-α-Syn-488 in WT- und LRP1-KO-iPSNs. d Aufnahme von α-Syn-488 in Gegenwart überschüssiger nicht markierter α-Syn-N-Terminus-Fragmente (N-α-Syn) oder α-Syn-Fragmenten ohne N-Terminus (ΔN-α-Syn). Alle Experimente in (b–d) wurden in technischen Duplikaten oder Dreifachversuchen über drei unabhängige Experimente hinweg durchgeführt. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, wobei einzelne Datenpunkte angezeigt werden. Die Daten in (b) wurden durch einen ungepaarten zweiseitigen t-Test analysiert. ***P < 0,001. Die Daten in (c und d) wurden durch eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest analysiert. NS, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Als nächstes wollten wir herausfinden, ob LRP1 die Aufnahme von α-Syn durch die Erkennung des lysinreichen N-Terminus von α-Syn reguliert. Wir verwendeten die α-Syn-Proteinfragmente, die nur den N-Terminus (N-α-Syn) enthielten oder denen der N-Terminus (ΔN-α-Syn) von α-Syn voller Länge fehlte (Abb. 3a). Anschließend markierten wir die N-α-Syn- und ΔN-α-Syn-Fragmente mit Fluoreszenz und untersuchten ihre Endozytose in iPSNs. Wir fanden heraus, dass LRP1-KO die Aufnahme von N-α-Syn wirksam in einem ähnlichen Ausmaß wie das Volllängen-α-Syn hemmte, jedoch keinen Einfluss auf die ΔN-α-Syn-Aufnahme hatte (Abb. 3c). Um diesen Befund weiter zu untermauern, haben wir getestet, ob N-α-Syn- oder ΔN-α-Syn-Proteinfragmente um die Aufnahme des α-Syn in voller Länge konkurrieren könnten. Wir behandelten die iPSNs mit fluoreszierend markiertem α-Syn voller Länge (100 nM) und dem fünffachen molaren Überschuss an nicht markierten N-α-Syn- oder ΔN-α-Syn-Fragmenten (500 nM). Nach dreistündiger Behandlung stellten wir fest, dass die Zugabe von N-α-Syn die Aufnahme von α-Syn voller Länge signifikant hemmte, wohingegen ΔN-α-Syn keine Wirkung hatte (Abb. 3d). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass LRP1 die Aufnahme von α-Syn über Lysinreste reguliert und der N-Terminus von α-Syn für die LRP1-vermittelte Aufnahme von α-Syn entscheidend ist.

Als nächstes testeten wir mithilfe eines Mausmodells, ob Lrp1 auch für die Ausbreitung von α-Syn in Neuronen in vivo entscheidend ist. Wir verwendeten einen AAV-Ansatz, der es uns ermöglichte, die Ausbreitung von α-Syn zwischen Hippocampus und Kortex zu visualisieren. Das AAV enthielt duale Synapsin-Promotoren, die eine effiziente Koexpression von GFP und h-α-Syn in Neuronen ermöglichten (AAV-Synapsin-GFP-Synapsin-h-α-Synuclein) (Abb. 4a). Neuronen, die mit dem Virus transduziert wurden, könnten GFP und h-α-Syn als zwei separate Proteine produzieren; wohingegen Neuronen, die h-α-Syn durch Ausbreitung von Zelle zu Zelle erhielten, basierend auf dem Design des AAV-Konstrukts nur h-α-Syn, aber kein GFP-Protein hätten (Abb. 4a). Um die Rolle von Lrp1 bei der α-Syn-Ausbreitung bei Tieren zu untersuchen, verwendeten wir die bedingten neuronalen Lrp1-Knockout-Mäuse [38], indem wir Lrp1flox/flox-Mäuse mit CaMKII-Cre-Mäusen kreuzten, um Lrp1-nKO (Lrp1flox/flox; Cre+/−) zu erzeugen. und WT-Wurfgeschwisterkontrollen (Lrp1flox/flox; Cre−/−). Es wurde berichtet, dass die durch CaMKII-Cre verursachte Deletion von Lrp1 im Kortex und Hippocampus nach einem Alter von 6 Monaten signifikant war [39]. Daher führten wir im Alter von 6 Monaten eine stereotaktische Injektion der AAVs in den rechten Hippocampus dieser Mäuse durch. Drei Monate nach der Injektion wurden die Mäuse zur Beurteilung der h-α-Syn-Ausbreitung eingeschläfert (Abb. 4a). Wir haben zunächst bestätigt, dass der endogene Lrp1-Proteinspiegel bei den Lrp1-nKO-Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollen, gemessen durch Western Blot, signifikant verringert war (Abb. 4b, c). Wir beobachteten, dass das GFP-Signal ausschließlich im Hippocampus, jedoch nicht in anderen Gehirnregionen exprimiert wurde (Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass nur die Neuronen in dieser Region wie geplant von den AAVs transduziert wurden (Abb. 4e). Innerhalb des Hippocampus zeigten sowohl das GFP- als auch das h-α-Syn-Signal keine signifikanten Unterschiede zwischen Lrp1-nKO- und WT-Mäusen, was auf eine äquivalente Transduktion von AAVs zwischen den beiden Gruppen hinweist (Abb. 4e, f und g). Interessanterweise fanden wir im Kortex über dem Hippocampus Neuronen, die nur h-α-Syn-, aber keine GFP-Signale hatten, was darauf hindeutet, dass diese Neuronen h-α-Syn vom Hippocampus erhielten. Die Quantifizierung dieser h-α-Syn-Signale im Kortex ergab eine signifikante Verringerung der Lrp1-nKO-Mäuse im Vergleich zu WT-Kontrollen (Abb. 4h, i), was darauf hinweist, dass die Lrp1-Deletion die Ausbreitung von α-Syn im Gehirn der Maus unterdrückt.

Neuronaler Lrp1-Knockout verringert die Ausbreitung von α-Syn in vivo. a Schematische Zeichnung für die stereotaktische Injektion von AAV-Synapsin-GFP-Synapsin-h-α-Synuclein in die neuronalen Lrp1-Knockout-Mäuse (Lrp1-nKO) und Wildtyp-(WT)-Wurfgeschwisterkontrollen sowie den experimentellen Arbeitsablauf. b und c: Western-Blot, der das endogene Lrp1-Protein im Kortex von WT- (n = 6) und Lrp1-nKO-Mäusen (n = 6) zeigt. d Repräsentative Abschnitte, die GFP- und h-α-Syn-Signale im Gehirn von Mäusen zeigen. Die gepunktete Linie markiert den Umriss jedes Abschnitts. Maßstabsbalken, 500 μm. e Repräsentative Bilder, die GFP- und h-α-Syn-Signale in der Hippocampus-Region von WT- und Lrp1-nKO-Mäusen zeigen. Maßstabsbalken, 50 μm. f Quantitative Analyse der GFP-Intensität im Hippocampus von WT- oder Lrp1-nKO-Mäusen. g Quantitative Analyse der h-α-Syn-Immunfluoreszenzintensität im Hippocampus von WT- oder Lrp1-nKO-Mäusen. h Repräsentative Bilder, die die Ausbreitung von h-α-Syn in die Kortexregion von WT- oder Lrp1-nKO-Mäusen zeigen. Maßstabsbalken, 50 μm. i Quantitative Analyse der h-α-Syn-Immunfluoreszenzintensität im Kortex von WT- oder Lrp1-nKO-Mäusen. Experimente in (e–i) n = 5 Mäusen (3 Männchen und 2 Weibchen) für WT und n = 6 Mäusen (3 Männchen und 3 Weibchen) für Lrp1-nKO-Mäuse. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, wobei einzelne Datenpunkte angezeigt werden. Die Daten wurden durch einen ungepaarten zweiseitigen T-Test analysiert. NS, nicht signifikant; *P < 0,05, ***P < 0,001

In dieser Studie untersuchten wir die Rolle von LRP1 bei der Aufnahme und Ausbreitung von α-Syn. Wir fanden heraus, dass ein LRP1-Mangel die neuronale α-Syn- und Tau-Aufnahme mithilfe von LRP1-KO-iPSNs, die mit der CRISPR/Cas9-Technik erzeugt wurden, signifikant reduzierte. Wichtig ist auch, dass wir mithilfe eines transgenen Mausmodells, das das Lrp1-Gen in Neuronen löscht, bestätigt haben, dass LRP1 die Ausbreitung von α-Syn im Gehirn von Mäusen vermittelt. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass LRP1 ein Schlüsselregulator für die Aufnahme und Ausbreitung von α-Syn und Tau ist und potenzielle therapeutische Erkenntnisse für die gezielte Behandlung relevanter Krankheiten mit α-Syn- und Tau-Pathogenese liefert.

Die Ausbreitung konformationell unterschiedlicher pathologischer Proteinaggregate zwischen anatomisch verbundenen Gehirnregionen ist ein gemeinsames Merkmal mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich Tauopathien und Synucleinopathien (30, 40). Es wurden verschiedene molekulare Mechanismen im Zusammenhang mit der Übertragung von Tau und der α-Syn-Pathologie beschrieben, darunter die rezeptorvermittelte Endozytose [29, 41, 42], der exosomale Transport [43,44,45] und der Tunnelnanoröhrentransport [46,47, 48] usw. Unter diesen unterschiedlichen Mechanismen wird gezeigt, dass die LRP1-vermittelte zelluläre Aufnahme und Ausbreitung ein gemeinsamer Mechanismus für die Übertragung von Tau von Zelle zu Zelle ist [29, 42] und α-Syn (aus dieser Studie). Als Zelloberflächenrezeptor reguliert LRP1 durch direkte Interaktion die Endozytose einer langen Liste von Liganden. Wir haben gezeigt, dass LRP1 über Lysinreste mit dem N-Terminus von α-Syn interagiert, ähnlich wie LRP1 mit Tau interagiert [29]. Wir beobachteten, dass neuronales LRP1 ein Schlüsselregulator für die Endozytose von monomerem und oligomerem α-Syn ist. Anders als bei Tau [29] zeigt unsere Studie jedoch, dass die Aufnahme der fibrillären Form von α-Syn in Neuronen weniger von LRP1 abhängt. Es wurde berichtet, dass im krankheitsbedingten aggregierten Zustand von α-Syn die N-terminalen Reste (37 bis 97) eine β-Faltblattstruktur annehmen [49]. Der Befund könnte darauf hindeuten, dass bei der Bildung der Fibrillen der N-Terminus von α-Syn weniger exponiert ist und daher die Wechselwirkung zwischen α-Syn und LRP1 möglicherweise begrenzt ist. Eine aktuelle Studie zeigte, dass das Lymphozytenaktivierungsgen 3 (LAG3) ein Rezeptor für α-Syn-PFFs ist, der die Endozytose und Übertragung von α-Syn-PFFs zwischen Neuronen vermittelt [41]. Bemerkenswerterweise bindet LAG3 spezifisch an α-Syn-PFFs, jedoch nicht an Monomere. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass unterschiedliche Formen von α-Syn von unterschiedlichen Rezeptoren erkannt werden. Obwohl die Rolle der Aufnahme und Ausbreitung löslicher α-Syn-Monomere immer noch kaum verstanden ist, ist gut dokumentiert, dass die α-Syn-Oligomere neurotoxisch sind und die wichtigsten α-Syn-Spezies sind, die als „Keime“ dienen und zu der Entstehung führen α-Syn-Aggregate [12,13,14, 50, 51]. Daher könnten sich zukünftige Studien auf die Identifizierung therapeutischer Strategien konzentrieren, um die Aufnahme und Ausbreitung oligomerer α-Syn-Spezies über den LRP1-bezogenen Weg zu stören.

LRP1 wird in zahlreichen Zelltypen exprimiert, darunter Neuronen, Astrozyten, Mikroglia, Makrophagen, Fibroblasten und glatte Muskelzellen. In unserer Studie haben wir die Rolle des neuronalen LRP1 bei der Vermittlung der Tau- und α-Syn-Aufnahme in Neuronen gezeigt. Ob jedoch auch andere Zelltypen wie Astrozyten und Mikroglia Tau und α-Syn über einen LRP1-vermittelten Mechanismus aufnehmen und verbreiten können, muss weiter untersucht werden.

Das ε4-Allel des APOE-Gens (APOE4) ist ein starker genetischer Risikofaktor für die Lewy-Körper-Demenz (LBD) [52, 53]. APOE4 ist auch am Fortschreiten kognitiver Beeinträchtigungen oder motorischer Dysfunktionen bei Parkinson beteiligt [54,55,56,57,58,59,60,61]. Kürzlich haben wir berichtet, dass das Vorhandensein des APOE4-Gen-Allels die α-Syn-Aussaat in einer großen AD-Kohorte und einer kleinen Kohorte von LBD-Fällen verschlimmert [62]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass APOE4 möglicherweise die α-Syn-Aggregation und -Ausbreitung während der Krankheit beschleunigt [63]. Tatsächlich ist LRP1 der wichtigste metabolische Rezeptor für APOE im Gehirn [25]. LRP1 vermittelt den Transport von Cholesterin und Phospholipiden in ZNS-Neuronen durch Bindung an APOE, um die synaptische Integrität und Plastizität zu unterstützen. Daher ist es möglich, dass APOE4 die α-Syn-Aggregation und -Ausbreitung über LRP1-bezogene Mechanismen beeinflusst. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Heparansulfat-Proteoglykane (HSPGs), ein weiterer APOE-Rezeptor, sowohl an der Tau- als auch an der α-Syn-Endozytose beteiligt sind [64, 65]. Es wurde berichtet, dass HSPGs an α-Syn-Fibrillen binden und deren Endozytose erleichtern [64]. Es ist bekannt, dass LRP1 in Verbindung mit HSPGs arbeitet. Beispielsweise vermitteln LRP1 und HSPGs kooperativ die zelluläre Aβ-Aufnahme [66]. Wie LRP1, HSPGs und APOE zusammen die Aufnahme und Ausbreitung von Tau und α-Syn beeinflussen, muss in geeigneten Modellsystemen weiter untersucht werden.

Zusammenfassend definiert unsere Studie LPR1 als einen Schlüsselrezeptor für die Aufnahme und Ausbreitung von α-Syn in Neuronen und stellt ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Synukleinopathien dar.

Die Daten dieser Studie sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

α-Synuclein

Parkinson-Krankheit

Ausschlagen

Induzierte pluripotente Stammzellen

Induzierte pluripotente, aus Stammzellen stammende Neuronen

Vorgeformte Fibrillen

α-Syn-N-Terminus

α-Syn ohne N-Terminus

Adeno-assoziiertes Virus

Löslicher N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor-Anlagerungsproteinrezeptor

Interstitielle Flüssigkeit

Liquor cerebrospinalis

Lipoprotein-Rezeptor-verwandtes Protein 1 niedriger Dichte

Lipoproteinrezeptor niedriger Dichte

Apolipoprotein E

Amyloid-Beta

Alzheimer-Erkrankung

Neuronale Vorläuferzellen

Rezeptor-assoziiertes Protein

Elektronenmikroskopie

Hydrophobe Nicht-Amyloid-Komponente

Lymphozytenaktivierungsgen 3

Lewy-Körper-Demenz

Heparansulfat-Proteoglykane

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Wir danken Dr. Hongmei Li für das Korrekturlesen des Manuskripts.

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse P01NS074969 (für GB und DMH) und U19AG069701 (für GB und Neuseeland), den Mayo Alzheimer's Disease Research Center Developmental Grant (für Neuseeland) und das Lewy Body Dementia Centre Without Walls U54NS110435 (für GB und Neuseeland) unterstützt.

Kai Chen und Yuka A. Martens haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Neurowissenschaften, Mayo Clinic, 4500 San Pablo Road, Jacksonville, FL, 32224, USA

Kai Chen, Yuka A. Martens, Axel Meneses, Wenyan Lu, Ana Caroline Raulin, Fuyao Li, Jing Zhao, Yixing Chen, Yunjung Jin, Cynthia Linares, Yonghe Li, Chia-Chen Liu, Takahisa Kanekiyo, Guojun Bu & Na Zhao

Abteilungen für Neurowissenschaften und Neurologie, University of Florida, Gainesville, FL, 32611, USA

Daniel H. Ryu, Marshall Goodwin und Todd E. Golde

Abteilung für Neurologie, Hope Center for Neurological Disorders, Knight Alzheimer's Disease Research Center, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

David M. Holtzman

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KC, YAM, GB und NZ entwickelten die Konzeption und das Design der Studie. KC und YAM erzeugten iPSC-abgeleitete Neuronen. KC, YAM, WL, JZ und YJ charakterisierten die iPSCs und von iPSC abgeleiteten Neuronen. KC und YAM führten die FACS-Messungen durch. KC führte Western Blot durch. KC, AM, FL und CL führten AAV-Injektionen durch. DHR produzierte das AAV. KC und MG erzeugten die AAV-Plasmide. YC führte eine Genotypisierung durch und half bei der Entnahme von Tiergewebe. YL war am Studiendesign beteiligt. CCL war an der Generierung der LRP1-KO iPSC-Linien beteiligt. TK stellte die Lrp1flox/flox- und CaMKII-Cre-Tiere zur Verfügung. DMH unterstützte das Studiendesign. TEG überwachte das Design und die Produktion von AAV. KC, NZ und GB haben das Manuskript mit kritischen Beiträgen und Bearbeitungen aller Co-Autoren verfasst. Die Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Guojun Bu oder Na Zhao.

Unzutreffend.

Alle Autoren stimmten der Veröffentlichung zu.

GB berät SciNeuro, war Berater für AbbVie, E-Scape, Eisai und Vida Ventures und ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Kisbee Therapeutics. DMH ist Erfinder eines von der Washington University an C2N Diagnostics lizenzierten Patents zur therapeutischen Verwendung von Anti-Tau-Antikörpern. DMH ist Mitbegründer und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von C2N Diagnostics. DMH ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Genentech, Denali und Cajal Neuroscience und berät Alector. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Erzeugung von LRP1-KO iPSC-Linien. a-gRNAs zielen auf Exon 6 des menschlichen LRP1-Gens ab. b Sequenzierungsergebnisse von LRP1-KO iPSC-Klonen. Sowohl die LRP1-KO #1- als auch die LRP1-KO #2-Klone weisen eine Deletion von 191 bp von Exon 6 auf, was zu einem Frameshift und einem vorzeitigen Stoppcodon führt. Abb. S2. Charakterisierung von Eltern- und LRP1-KO-iPSCs. eine Karyotypisierung für die iPSCs. b Immunfärbung für Pluripotenzmarker (Nanog und TRA-1-60). Maßstabsbalken, 100 μm.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, K., Martens, YA, Meneses, A. et al. LRP1 ist ein neuronaler Rezeptor für die Aufnahme und Ausbreitung von α-Synuclein. Mol Neurodegeneration 17, 57 (2022). https://doi.org/10.1186/s13024-022-00560-w

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Eingegangen: 31. Mai 2022

Angenommen: 09. August 2022

Veröffentlicht: 02. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-022-00560-w

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